Genotyping of South American clinical isolates of Pythium insidiosum based on single nucleotide polymorphism-based multiplex PCR / Genotipagem de isolados clínicos de Pythium insidiosum da América do Sul utilizando polimorfismos de nucleotídeo único baseado em PCR multiplex

ABSTRACT: We aimed to genotype the South American clinical isolates of Pythium insidiosum using the single nucleotide polymorphisms (SNP) of the ribosomal DNA sequences (rDNA). Previously, an SNP-based multiplex-PCR was able to distinguish three different clades of P. insidiosum isolates. Thus, we used this assay to evaluate South American clinical isolates of P. insidiosum (n=32), standard strains from Costa Rica (n=4), Thailand (n=3), Japan (n=1), and India (n=1), a standard strain of Pythium aphanidermatum, and Brazilian environmental isolates of Pythium torulosum, Pythium rhizo-oryzae and Pythium pachycaule voucher (n=3). It was possible to allocate each American P. insidiosum isolate to clade I, the isolates of India, Japan, and Thailand to clade II, and the Thai isolate to clade III. P. aphanidermatum, P.torulosum, P.rhizo-oryzae and P.pachycaule voucher isolates were not amplified. For the first time, a P. insidiosum isolate from Uruguay, South America, was included in molecular analyzes. By SNP-based multiplex-PCR, it was possible to perform the identification and genotyping of the South American isolates of P. insidiosum, demonstrating similar genetic characteristics of these isolates.

RESUMO: O objetivo deste estudo foi genotipar isolados clínicos de Pythium insidiosum da América do Sul utilizando polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) de sequências de rDNA. Anteriormente, um multiplex-PCR baseado em SNP foi capaz de distinguir P. insidiosum em três diferentes clados. Dessa forma, utilizamos este método para avaliar isolados clínicos de P. insidiosum da América do Sul (n=32), cepas padrão da Costa Rica (n=4), Tailândia (n=3), Japão (n=1) e Índia (n=1), uma cepa padrão de Pythium aphanidermatum e isolados ambientais brasileiros de Pythium torulosum; Pythium rhizo-oryzae e Pythium pachycaule voucher (n=3). Os isolados analisados foram alocados aos clados: I (americanos), II (isolados da Índia, Japão e Tailândia), e III (um isolado tailandês). P. aphanidermatum, P.torulosum, P.rhizo-oryzae e P.pachycaule voucher não foram amplificados. Pela primeira vez, um isolado de P. insidiosum do Uruguai foi incluído em análises moleculares. Através da multiplex-PCR baseada em SNP, foi possível realizar a identificação e genotipagem dos isolados sul-americanos de P. insidiosum, demonstrando características genéticas semelhantes entre esses isolados.

Detection of Listeria spp. in cattle and environment of pasture-based dairy farms / Detecção de Listeria spp. em gados leiteiros no meio ambiente com base na pastagem

The aim of the study was to detect Listeria spp., particularly Listeria monocytogenes, in cattle and environment of pasture based dairy farms in Paysandú, Uruguay. A two-stage sampling was conducted, 10 farms were selected by probability proportional to size. A single visit was made to each farm. Samples from bovine faeces, feedstuffs, bulk tank milk, drinking water and soil from the entry and exit pens of the milking parlour were collected for bacteriological studies. PCR assays were used to confirm species and determine the serotype profile of L. monocytogenes isolates. AscI-pulsed-field gel electrophoresis was done to genetically compare them. Listeria spp. were isolated from eight of ten dairy farms, whereas L. monocytogenes in three of them. Serotype distribution in L. monocytogenes was as follows: 1/2a, three isolates; 4b, one isolate. L. monocytogenes or L. innocua excreted from clinically healthy milking cows was detected via faeces. In feedstuffs, only one L. monocytogenes 1/2a isolate from a pasture was obtained. The strain was identical by PFGE to an isolate 1/2a obtained from a pool of milking cow feces that grazed on this farm. No isolation of Listeria spp. was retrieved from the bulk tank milk or drinking water from any of the farms. Listeria innocua was detected in 13 feedstuffs and seven samples of soil from the entry and exit pens of the milking parlour. This is a first local study that confirms the presence of Listeria spp. including L. monocytogenes in healthy cattle and environment of pasture-based dairy farms. These results suggest the potential role that healthy cattle and their sub-products would play as a source of these agents for humans and/or others animals. More detailed studies that include genetic comparison of human and animal isolates are required in order to clearly establish the epidemiological relationship.(AU)

O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de bactérias do gênero Listeria e particularmente Listeria monocytogenes, em bovinos leiteiros no ambiente de Paysandú, Uruguai. Foi realizada uma amostragem em duas etapas, dez estabelecimentos foram selecionados por probabilidade proporcional ao tamanho. Foi realizada uma única visita a cada propriedade. Foram coletadas amostras para cultura bacteriológica de matéria fecal bovina, além de alimentos, leite do tanque de resfriamento, água e solo na entrada e saída da sala de ordenha. Com os isolados de L. monocytogenes foi realizado PCR para a confirmação da espécie e determinação do perfil do serotipo. AscI-elctroforese em gel de campo pulsado foi realizado para compará-los geneticamente. Listeria spp. foram isoladas de oito de dez estabelecimentos, enquanto L. monocytogenes foram detectadas em três deles. A distribuição dos serotipos nos isolados de L. monocytogenes recuperados foi: 1/2a três isolados, 4b um isolado. Foram detectadas vacas leiteras clinicamente sadias ​​que excretaram L. monocytogenes ou L. innocua nas fezes. Dos alimentos do gado houve só um isolamento de L. monocytogenes 1/2a em uma pastagem. Esta estirpe foi idêntica no PFGE a um isolado 1/2a obtido de uma "piscina" de fezes de vacas leiteiras do mesmo estabelecimento. Não houve isolamento de Listeria no leite do tanque de resfriamento ou na água de nenhum dos estabelecimentos. Listeria innocua foi detectada em 13 alimentos para o gado e sete amostras de solo na entrada e saída da sala de ordenha. Este parece ser o primeiro estudo local que confirma a presença de Listeria spp. incluindo L. monocytogenes em vacas leiteiras sadias e no meio ambiente de propriedades leiteiras com base alimentícia na pastagem. Esses resultados sugerem o potencial de vacas sadias e seus subprodutos como possível fonte desses agentes para humanos e/ou outros animais. São necessários estudos mais detalhados que incluem a comparação genética de isolados humanos e de animais para estabelecer claramente seu relacionamento epidemiológico.(AU)

Accidental and experimental Closantel intoxication in Uruguayan sheep / Intoxicação acidental e experimental por Closantel em ovinos no Uruguai

An outbreak of Closantel intoxication in sheep in Uruguay is described. The outbreak occurred in a group of 1300 weaning lambs treated orally with a 10% solution of Closantel. One hundred forty eight lambs showed clinical signs of intoxication and 14 died. The clinical signs included mydriasis, nystagmus, and negative pupillary reflex, bilateral blindness, bump into objects, and lateral movement of the head. No macroscopic lesions were observed. The histological lesions of the retina were cytoplasmic vacuolization in ganglion cells and in cells of the inner and outer nuclear layers with different degrees of atrophy. Vacuolization and axonal degeneration were observed in the optic nerve, with multifocal areas of fibrosis and infiltration by lymphocytes and Gitter cells. To reproduce the intoxication, four sheep were given two, four and 10 times the therapeutic dose of Closantel (0.1g/kg of BW). Only the animals receiving 10 times the recommended dose showed clinical signs. The histological examination of the lesions in experimental sheep showed similar results to those described in the accidental outbreak, except for the absence of optic nerve fibrosis and inflammation, characterizing an acute phase. Axonal myelin sheaths loss, fibroblasts and collagen fibers were observed in the ultrastructural study of the optic nerve of accidental intoxicated animals. The optic nerve of experimentally intoxicated animals had vacuoles that separated the myelin sheaths of axons. To prevent outbreaks it is suggested to weigh the animals before Closantel administration to avoid errors in dose calculation.

Descreve-se um surto de intoxicação por Closantel em ovinos no Uruguai. O surto ocorreu em um lote de 1300 cordeiros que foram dosados com uma solução de Closantel 10%, por via oral. Do total, 148 apresentaram sinais clínicos de intoxicação e 14 morreram. Os sinais clínicos incluíam midríase, nistagmo, reflexo pupilar negativo, cegueira bilateral, pressão da cabeça contra objetos e desvio lateral da cabeça. Lesões macroscópicas não foram observadas. Histologicamente havia vacuolização citoplasmática das células ganglionares e nas células das camadas nuclear interna e externa. Na retina havia, também, diferentes graus de atrofia. Vacuolização e degeneração axonal foram observados no nervo óptico, com áreas multifocais de fibrose e infiltrado de linfócitos e células Gitter. Quatro ovinos receberam experimentalmente duas, quatro e 10 vezes a dose terapêutica de Closantel (0,1 g/kg de peso vivo). Apenas os animais que receberam 10 vezes a dose recomendada apresentaram sinais clínicos. O exame histológico nos ovinos experimentais mostrou resultados semelhantes aos do surto, com exceção da ausência de fibrose e infiltrado inflamatório do nervo óptico, caracterizando um quadro agudo. Foram observadas a perda da bainha de mielina dos axônios e a presença de fibroblastos e fibras colágenas no estudo ultra-estrutural do nervo óptico de animais intoxicados espontaneamente. No nervo óptico de animais intoxicados experimentalmente havia vacúolos que separavam as bainhas de mielina dos axônios. Para evitar surtos, sugere-se pesar os animais antes da administração de Closantel para evitar erros no cálculo da dose.

Diagnóstico de febre catarral maligna em bovinos do Uruguai / Diagnosis of malignant catarrhal fever in cattle in Uruguay

Foi realizado um estudo retrospectivo de 14 focos de febre catarral maligna (FCM) em bovinos, detectados nos anos de 1999-2011, a partir dos arquivos da Seção Anatomia Patológica da Divisão de Laboratórios Veterinários (DILAVE) "Miguel C. Rubino" Montevideo. Foram analisados os dados epidemiológicos, apresentação clínica e lesões macroscópicas e histopatológicas. Para a detecção do herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) foi utilizada a técnica de PCR sobre as amostras do sistema nervoso central de bovinos de 12 focos. Os surtos ocorreram principalmente nos meses de primavera e verão, na região norte do país. Em 64% (9/14) dos focos ocorreram episódios individuais da enfermidade, enquanto que os casos coletivos foram 5, nos quais a morbidade e mortalidade oscilaram entre 2% e 5%, sendo a letalidade 100% em todos os relatos. Em 50% dos surtos foi confirmado o contato direto entre bovinos e ovinos, enquanto no restante não havia tal informação. Clinicamente predominaram os sinais de opacidade bilateral da córnea, conjuntivite, secreção nasal e ocular mucopurulenta, assim como a síndrome nervosa. Os achados de necropsia mais frequentes foram opacidade bilateral da córnea e lesões inflamatórias nas mucosas. Os achados histopatológicos caracterizaram-se por panvasculite necrótica sistêmica. Foi possível detectar o agente etiológico por PCR em 5 dos 12 casos analisados.

A retrospective study of 14 outbreaks of malignant catarrh fever (MCF) in cattle detected between 1999 and 2011 was performed based upon the files of the DILAVE "Miguel C. Rubino" Montevideo Pathology Laboratory. Epidemiological data, clinical presentation, gross and histopathological lesions were analyzed. PCR was used on central nervous system samples of 12 bovines for the detection of ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2). The outbreaks occurred mainly in spring and summer in the northern region of the country. Sixty four percent (9/14) were individual episodes of the disease while five cases were collective, with morbidity and mortality rates were 2-5%, being the lethality 100% in all the reports. In 50% of the outbreaks the direct contact between cattle and sheep was confirmed, while there was not such information in the rest of the cases. Predominant clinical signs were bilateral corneal opacity, conjunctivitis, ocular and nasal mucopurulent discharge, and nervous syndrome. The most frequent necropsy findings were bilateral corneal opacity and inflammatory lesions in the mucosa. Histopathological findings were characterized by systemic necrotizing panvasculite. It was possible to detect the etiological agent by PCR in 5 out of 12 cases examined.

Parasite meningomyelitis in cats in Uruguay / Meningomielites parasitária em gatos no Uruguai

Two outbreaks of progressive hind limb paresis in cats (Felis catus) caused by parasitic meningomyelitis in Uruguay are reported. The case studies occurred in 2008 and 2009 respectively, in the rural areas of Fray Bentos (33º 07' 40.39" S) and were characterized by hindquarter paralysis. This paralysis was progressive and had a chronic progression of approximately 12 months until the death or euthanasia of the animals. Clinical symptoms started with ataxia of the hindquarters with lateral side-to-side swaying and culminated in total paralysis. Two animals were sent for necropsy in 2009. The main histopathological findings were severe myelitis in the lumbar spinal cord with perivascular cuffing and white matter necrosis, severe nonsuppurative meningitis with thrombi in subarachnoid blood vessels, and intravascular presence of multiple adult parasites. From the morphological characteristics of the parasites and location in the leptomeninges, the parasite was identified as the nematode Gurltia paralysans.

São relatados dois surtos de paralisia progressiva dos membros posteriores em gatos (Felis catus), causada por meningomielite parasitária no Uruguai. Os estudos de casos ocorreram entre os anos 2008 e 2009, respectivamente, nas zonas rurais de Fray Bentos (33º 07' 40,39" S) e foram caracterizados por paralisia dos membros posteriores. Esta paralisia era progressiva e tinha evolução crônica de aproximadamente 12 meses, até que os animais vinham a óbito ou eram eutanasiados. Os sintomas clínicos começaram com ataxia dos membros posteriores, com movimentos laterais, terminado em paralisia total. Em 2009, dois animais foram encaminhados para necropsia. Os achados histopatológicos foram caracterizados por severa mielite na medula espinhal lombar com manguitos perivasculares linfocitarios e necrose da substância branca, severa meningite não supurativa com trombos nos vasos sanguíneos subaracnóideos, e presença intravascular de múltiplos parasitos adultos. De acordo com as características morfológicas dos parasitos e localização nas leptomeninges, este foi identificado como um nematóide da espécie Gurltia paralysans.